MAGYAR ONKOLÓGIAVol 53, No. 1, 2009

 Áttekintés

Az emberi májrák komparatív genomikai osztályozása

Kaposi-Novák Pál1

1Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola, Semmelweis Egyetem, Budapest
2II. sz. Patológiai Intézet, Semmelweis Egyetem, Budapest

A génexpresszió microarray-alapú globális elemzése sikeresen alkalmazható a humán tumorok, közöttük a primer májrákok karakterizálására. A microarray technológia elõsegítheti a rákbetegek korai diagnózisát, prognosztikus és terápiás klasszifikációját. Annak érdekében, hogy az archivált patológiai mintákban elrejtett genomikai információhoz jobb hozzáférést biztosítsunk, három különbözõ fixálószerrel kezelt, paraffinba ágyazott szöveteken vizsgáltuk az RT-PCR reakciók hatékonyságát. Minden fixálószer estén megbízható amplifikációt kaptunk, amennyiben az amplikon mérete nem haladta meg a 225 bp-t. A termékhossz további növekedésével azonban a reakció hatékonysága és reprodukálhatósága gyorsan csökkent. A legjobb szöveti morfológiát és a legegyenletesebb claudin-4 és claudin-7 immunhisztokémiai festést ugyanakkor a formalin-fixált minták estén láttuk. A konvencionális lineáris RNS-amplifikációs protokollt egy random nonamer T3-polimeráz lépéssel módosítottuk. A T7T3 amplifi káció olyan "sense" szálú terméket hozott létre, ami indirekt jelölt cDNS-templáttá volt konvertálható. A fagyasztott és mikrodisszektált Myc és Myc/TGF-α egértumorok microarray-elemzése az amplifikációt követõen jól reprodukálható expressziós profilokat (r=0,9) eredményezett, az eredeti expessziós mintázatok megtartottak voltak (r=0,78). A HGF-kezelt, c-Met kondiconális knock-out és kontroll egerekbõl származó májsejtek expressziós profiljainak összehasonlításával 690, a HGF/c-Met útvonal által szabályozott gént azonosítottunk. A szignifikáns gének funkcionális elemzése azt mutatta, hogy a c-Met receptor a májsejtek motilitásának és oxidatív homeosztázisának fontos regulátora. A c-Met-indukált expressziós mintázat kifejezõdését humán HCC-kben is vizsgáltuk, és beazonosítottuk a humán tumorok egy csoportját (27%), melyekben a c-Met útvonal aktivációja valószínûsíthetõ (MET+). E tumorokra a gyakori vaszkuláris invázió, a magas mikrovaszkuláris sûrûség és a többihez képest rövidebb túlélés volt jellemzõ. Egy, a 111 evolucionálisan konzervált c-Met-célgén expresszióján alapuló predikciós modell pedig 83-95%-os pontossággal volt képes a májkarcinómás betegeket a jó és a rossz túlélést mutató csoportokba szétválogatni. Összességében kutatásaink megmutatták, hogy a gondos kísérlettervezés és a legkorszerûbb molekuláris metodikák felhasználása mellett archivált és ezáltal ritka mintákon is lehetõvé válik a globális génexpresszió elemzése. A komparatív genomikai analízis segítségével pedig olyan új molekuláris klaszszifikációs rendszereket hozhatunk létre, amelyek nélkülözhetetlenek az individualizált daganatterápiás protokollok létrehozásához. Magyar Onkológia, Vol 53, Nr. 1, 61-67, 2009

Kulcsszavak: máj; hepatocelluláris karcinóma; transzgén egér; génexpresszió; genomikai klasszifikáció

Comparative genomic classification of human hepatocellular carcinoma. Global transcriptome analysis has been successfully applied to characterize various human tumors, including hepatocellular carcinomas. This novel technology can facilitate early discovery as well as prognostic and therapeutic diversification of cancer patients. To enhance access to the genomic information buried in archived pathology samples, we assessed RT-PCR amplification rates in paraffin-embedded tissues preserved in three different fixatives. Reliable amplification could be achieved from all paraffin-embedded specimens, when the amplicon size did not exceed 225 bp. A longer amplicon size resulted in rapid decrease of yield and reproducibility. In addition, formalin provided superior morphology and better reactivity with claudin-4 and -7 immunohistochemistry. Amplification of the initial sample is often required before transcriptome analysis of clinical specimens could be performed. We introduced a random nonamer primed T3 polymerase reaction into the conventional linear RNA amplification protocol. The modified T3T7 method generated a sense strand product ideal for synthesizing indirectly labeled cDNA templates. Microarray analysis of amplified frozen and laser-microdissected Myc and Myc/TGFα mouse liver tumors confirmed good reproducibility (r=0.9) of the reaction and conservation of original transcriptional patterns (r=0.78). Finally, we tested the utility of expression profiling for the classification of human HCC samples. By comparing expression data from HGF-treated c-Met conditional knock-out and control primary mouse hepatocytes, we identified 690 HGF/c-Met target genes. Functional analysis of the significant gene set implicated c-Met as key regulator of hepatocyte motility and oxidative homeostasis. Cross comparison of the c-Met-induced transcription signature with human HCC expression profiles revealed a group of tumors (27%) with potentially activated c-Met signaling (MET+). These tumors were characterized by higher vascular invasion rate, increased microvessel density, and shortened survival. A prediction model based on 111 cross-species conserved c-Met signature genes was able to diversify HCC patients into good and bad prognostic groups with 83-95% accuracy. Our results therefore demonstrate that careful experimental design and state-of-the-art laboratory methods could open the way for global expression profiling of archived and limited availability pathologic samples. Comparative functional genomics based analysis of the cancer transcriptome could lead to novel molecular classification systems which are essential for the introduction of individualized cancer therapeutics. Hungarian Oncology, Vol 53, Nr. 1, 61-67, 2009


Beküldve: 2009. január 10.; elfogadva: 2009. február 10.
Elérhetőség: Kaposi-Novák Pál, II. sz. Patológiai Intézet, Semmelweis Egyetem, 1091 Budapest Üllõi út 93.; Tel: (06-1) 215-6921, Fax: (06-1) 215-6921

Kattintson ide a teljes (PDF) változat letöltése végett!
ad