MAGYAR ONKOLÓGIAVol 46, No. 1, 2002

 Közlemény

N-myc-amplifikáció vizsgálata neuroblastomában PCR-alapú módszerekkel

Melegh Zsombor1, Bálint Ildikó1, Nagy Kálmán2, Magyarosy Edina3, Galántai Ilona4, Szentirmay Zoltán1

1Molekuláris Pathologiai Osztály, Országos Onkológiai Intézet, Budapest
2I. Gyermekhaematológiai-és Csontvelôtranszplantációs Osztály, Borsod-Abaúj-Zemplén Megyei Kórház, Miskolc
3Haematológiai és Onkológiai Osztály, Fôvárosi Heim Pál Gyermekkórház-Rendelôintézet, Budapest
4Belgyógyászati Osztály, Madarász Utcai Gyermekkórház-Rendelôintézet, Budapest

21 fagyasztott neuroblastomás tumorminta, valamint az IMR 32 neuroblastoma sejtvonal n-myc-génamplifikációját vizsgáltuk szemikvantitatív és valós ideju kvantitatív PCR eljárásokkal, a daganatok várható biológiai viselkedésének megítélése céljából. A szemikvantitatív meghatározás során a belsõ
konrollként használt béta-globin gén 520 bp, valamint az n-myc gén 258 bp hosszú fragmentjeit egy csõben amplifikáltuk. 30 ciklus után a termékeket agaróz gélen futtattuk, majd géldenzitométerrel egymáshoz viszonyítottuk az n-myc és a ß -globin géntermék sávjának intenzitását. A valós ideju kvantitatív vizsgálatot LightCycler készülékkel végeztük. Az n-myc génre illeszkedõ primerpárral 120 bp hosszú fragmentet amplifikáltunk, a termék detektálásához LC640-nel fluoreszcensen jelölt próbapárt használtunk. A kvantitatív analízis 1, 2, 10, 13, 25-szörös amplifikációt tartalmazó mintákból felállított
kalibrációs görbe segítségével történt. A szemikvantitatív eljárással 10-szeresnél kisebb mértéku
amplifikációt mutató és a nem amplifikált tumorokat nem lehetett biztonsággal elkülöníteni, míg valós ideju kvantitatív analízissel akár kétszeres amplifikációt is detektálni tudtunk. Két szövettanilag differenciált, de n-myc-amplifikációt mutató tumor esetében in situ PCR-vizsgálatot végeztünk a LightCyclernél használt primerpárokkal, biotinilált ATP jelöléssel. Mindkét esetben kimutatható volt a neuroblastokban az n-myc-génamplifikáció, míg a differenciált sejtalakok nem mutattak amplifikációt. Magyar Onkológia, Vol 46, Nr. 1, 43-48, 2002

Detection of n-myc gene amplification in neuroblastoma using polymerase chain reaction based methods. We have used semiquantitative and real-time quantitative PCRs to detect n-myc gene-amplification in 21 frozen neuroblastoma biopsies and IMR 32 cell line in order to predict biological behaviour of the tumors. Two primer pairs were used in the semiquantitative method to co-amplify a 520-bp fragment of the beta -globin gene -used as a single copy reference standard -and a 258-bp fragment of the n-myc gene. After 30 cycles the PCR products were electrophoresed through an agarose gel and were compared to each other with use of a gel-densitometer. Real-time quantitative analysis was performed in a LightCycler instrument. A single primer pair was used to amplify a 120-bp fragment of the n-myc oncogene and a LC640-labelled fluorescent probe pair to detect the product. Calibration curve, which was set up from a serial dilution including samples with 1, 2, 10 , 13, 25-fold n-myc oncogene amplification, was employed for quantitative analysis. Semiquantitative method did not show distinct difference between tumor groups with no amplification and less than 10-fold amplification, while quantitative LightCycler analysis was able to detect even 2-fold amplification. In situ PCRs were performed in two cases of differentiated tumor samples which contained n-myc amplification. We used biotinylated ATP labelling and the same primer pair as for the LightCycler analysis.In both cases differentiated cell forms did not show n-myc gene amplification, while considerable amplification was detected in the neuroblasts. Hungarian Oncology, Vol 46, Nr. 1, 43-48, 2002


Beküldve: 2002. január 31.; elfogadva: 2002. február 15.
Elérhetőség: Melegh Zsombor, Molekuláris Pathologiai Osztály, Országos Onkológiai Intézet, H1122 Budapest Ráth György u. 7-9; Tel: 36(1) 224-8600/1403, Fax: 36(1) 224-8620; E-mail: melegh@oncol.hu

Kattintson ide a teljes (PDF) változat letöltése végett!
ad